L'attività della famiglia Sestieri nel mercato antiquario iniziò con Pellegrino Sestieri, il quale aprì la "Galleria Sestieri" in via Fontanella Borghese 29-33, per poi trasferirsi in via Maria Cristina 5, nello studio del pittore Hermann Corrodi. All'inizio della sua carriera Pellegrino trattava principalmente tessuti antichi e oggetti del Settecento, ma con il tempo iniziò a commerciare antichità, dipinti e sculture italiane. I suoi figli, Ercole, Emanuele (1887-1953) e Guido (1890-1954) - che commerciava in reperti classici con un proprio negozio in via Margutta 53 fino al 1939 - furono tutti antiquari legati alla "Galleria Sestieri", mentre Ettore, noto studioso e assistente di Adolfo Venturi all'università, fu attivo e apprezzato critico d'arte.

Sulla scia del grande successo che aveva a quel tempo l'arte italiana negli Stati Uniti, Guido ed Emanuele Sestieri aprirono insieme una succursale a New York nel corso degli anni Venti, che rimase aperta fino alla crisi del 1929. Nel 1932 la galleria situata in via Maria Cristina venne chiusa congiuntamente dai diversi membri della famiglia, ma prima della promulgazione delle leggi razziali, che costrinse i Sestieri alla sospensione dell'attività, il negozio venne riaperto in via Sistina 94 e gestito da Emanuele.

Infine, nel 1944, poco dopo l'arrivo degli alleati a Roma, la ditta si trasferì in piazza di Spagna 81, in uno spazio che ospitava ampi locali espositivi e un'importante biblioteca, frequentata da colleghi, storici dell'arte e amici. All'ultimo piano dell'edificio vi era, inoltre, un appartamento che allocava lo studio dei restauratori, sotto la guida di Alvaro Esposti. Nell'attività di Emanuele vennero presto coinvolti i figli Carlo (1922-1998), esperto di dipinti antichi, e Marcello (1920-1995), specializzato in arti decorative, porcellana e argenti, un interesse nato grazie all'amicizia con Pietro Accorsi (1891-1982), noto antiquario torinese.

Molti furono gli storici dell'arte che frequentavano la Galleria Sestieri e ai quali gli antiquari facevano riferimento; tra questi figurano Federico Zeri, Giuliano Briganti, Maurizio Calvesi, Alvar Gonzáles-Palacios, Bruno Molajoli, Raffaello Causa, Italo Faldi e Ferdinando Bologna. Federico Zeri iniziò a frequentare la Galleria Sestieri quando questa era gestita ancora da Emanuele. Il rapporto si consolidò soprattutto grazie all'amicizia che il conoscitore romano instaurò con Carlo. I due compirono insieme numerosi viaggi in Inghilterra, dove i Sestieri compravano dipinti provenienti dall'Italia da immettere nuovamente sul mercato italiano.